Pētījuma nosaukums: Fluorescences multi lāzeru kombinācijas ierosmes sistēmas izpēte augstas veiktspējas mikroskopijas instrumentam un Neironu Tīklu baktēriju kvantizācijas un klasifikācijas moduļa izveide

Pētījuma mērķis

Gadu gaitā SIA Apply ir uzkrājis būtisku zināšanu kopu attiecībā uz automatizētu augstas veiktspējas mikroskopijas sistēmu izveidi – sadarbībā ar Conelum SIA tika izstrādāts automatizēts mikroskops rauga un pelējuma sēnīšu noteikšanai piena produktos, pārtikas kvalitātes kontrolei.

Turpinot meklēt ceļus, kā potenciāli komercializēt šīs zināšanas, vienlaicīgi paaugstinot arī citu Latvijas uzņēmumu konkurētspēju, piedāvājot risinājumus ar augstu pievienoto vērtību, identificējām, ka Rīgas Tehniskās Universitātes Ūdens sistēmu un biotehnoloģiju institūtā ikdienas darbā tiek izmantota fluorescentā mikroskopija, kur paraugu rezultāts tiek iegūts, mikroorganismus uzskaitot manuāli – laborantam veicot pozitīvo objektu uzskaiti un reģistrēšanu MS Excel vai līdzvērtīgā programmā. Lai samazinātu ieguldītā darba apjomu un iegūtu ticamākus (ar minimālu cilvēka kļūdas faktoru) rezultātus, ir aktuāla mikroskopijas sistēma, kas varētu veikt automatizētu mikroorganismu šūnu uzskaiti dažādos paraugos.

Pētījuma ietvaros tiks risināta sekojošas problēmas:

• ir identificēta nepieciešamība izmantot vairākus ierosmes spektrus, jo RTU veiktajās mikroskopijas analīzēs tiek izmantoti vairāki fluorofori ar dažādiem ierosmes pīķa spektriem. Tā kā ir runa par augstas veiktspējas sistēmas izpēti, tad tiks izmantota augstas izšķirtspējas (~50 megapikseļu) zinātniskā kamera, un ir nepieciešamība izmantot lāzerus kā ierosmes gaismas avotus to ļoti augstās efektivitātes dēļ, lai iegūtu minimālu ekspozīcijas laiku un izvairītos no mikroorganismu fluorescences degradācijas. Attiecīgi tiks risināta problēma, kā kombinēt vairākus dažāda spektra lāzerus kā to pārraides mediju izmantojot optiskās šķiedras;
• ir identificētas augstas prasības pret mikroorganisma dzīvības pazīmju morfoloģiju. RTU pētnieciskajā darbā tiek strādāts arī ar baktērijām (piemēram Escherichia coli), kuru izmērs var būt mazāks kā viens mikrometrs un dzīvības procesa signāla izmērs var būt apmēram 500 nanometri, kas ir praktiski uz tehnisko robežu iespējām optiskajā mikroskopijā, kā arī baktēriju dzīvības procesu signāls var būt false positive (neliecinošs par baktērijas dzīvīgumu) vai arī viena baktērija var signalizēt vairākkārt, bet to nedrīkst interpretēt kā vairākus signālus. Attiecīgi manuāli tiks ievākti optiskie mikroskopijas dati, tie marķēti un apmācīti precīzi dzīvības signālu klasifikācijas un baktēriju segmentācijas neironu tīklu modeļi;
• sistēma tiks validēta  RTU Ūdens sistēmu un biotehnoloģiju institūta laboratorijā praktiskā lietojumā paralēli esošajiem manuālajiem laborantu darbiem.

Projekta beigās tiks izveidota un validēta automatizēta mikroskopijas sistēma, kura spēs patstāvīgi un atkārtojami kvantizēt un klasificēt dzīvas/mirušas baktērijas pēc RTU metodes sagatavotos ūdens paraugos uz mikroskopijas slaidiem laikā, kas nav ilgāks, kā to šobrīd veic kvalificēts laborants.

Pētījuma rezultāti

Pētījumā tika izstrādāta un validēta automatizēta fluorescences mikroskopijas sistēma mikroorganismu kvantificēšanai un klasificēšanai.  Galvenais mērķis bija izveidot sistēmu, kas nodrošina ātrāku un precīzāku analīzi, nekā tradicionālās metodes, vienlaikus samazinot laborantu darba slodzi.

Projekta gaitā tika izstrādāta inovatīva multi-lāzeru kombinācijas sistēma, kas spēj apvienot četrus dažādu spektru lāzerus un kas optimizēta darbam ar DAPI fluorescences marķieri, izmantojot ekonomiski efektīvu 405nm violeto lāzeru.

Sistēma tika aprīkota ar augstas izšķirtspējas 20MP Sony IMX183 sensoru un īpaši projektētām mehāniskajām komponentēm stabilitātes nodrošināšanai.  RTU izstrādāja standartizētu protokolu paraugu sagatavošanai un validācijai.  Baktēriju detekcijai un klasifikācijai tika implementēta YOLOv8 mākslīgā intelekta arhitektūra.

Validācijas rezultāti uzrādīja labu korelāciju ar tradicionālajām metodēm, īpaši Gramnegatīvo baktēriju gadījumā ar koncentrācijām līdz 1*10^6 šūnām uz membrānas.  Izstrādātā sistēma sasniedza TRL6 līmeni, demonstrējot praktisko pielietojamību laboratorijas vidē.

Sistēma spēj veikt viena parauga analīzi aptuveni 10 minūtēs, kas ir salīdzināms ar manuālo analīzi, taču nodrošina papildu priekšrocības, piemēram, iespēju laborantam veikt citus darbus analīzes laikā un automātisku datu saglabāšanu.

Projekta rezultāti tika prezentēti IUMS 2024 konferencē un publicēti Frontiers Abstraktu grāmatā.